粪大肠菌群的监测分析方法？

1、粪大肠菌群

粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，用来表明水质受污染的程度，主要来自粪便。粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5 ℃培养24~48ｈ能发酵乳糖产酸产气。通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。粪大肠菌群适 用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水，尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标。粪大肠菌群作为地表水环境质量标准WY的一项微生物监测指标，我国多用多 管发酵法进行检测，近几年也更新了好几个相关环境标准。

2、样品的采集和保存

2.1 采样瓶的准备和存放

采集粪大肠菌群的采样瓶需要用牛皮纸封包好后，再经过高压灭菌器灭菌才能使用。灭菌后的采样瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。有条件的单位，也可以使用无菌采样瓶。灭菌后的采样瓶也有其保存期，超过两周内未使用就必须重新灭菌。绝大部分实验室都是在首次灭菌后不再管其使用期
限。采样瓶存放过久可能受到杂菌污染。

2.2 样品采集

采样人员大多缺乏细菌学监测知识，出现很多采样不规范的现象。如：微生物项目水样和理化水样混采；灭菌瓶开盖时间过早、水样在空气中暴露
时 间 过 长；水样采集量过满（既容易导致水样中细菌缺氧死亡，又不利于水样检测前振荡摇匀）；微生物样品和其他理化项目同时采样时，没有做到细菌样品优先采集；采样人员在采集样品时，没注意避免采样瓶受杂菌污染（手接触到瓶盖和瓶颈、采样设备不规范）。

2.3 样品运输保存

在样品的运输和保存过程中，样品的冷藏是关键（温度过高过低都不利于样品的保存）。由于仪器设备条件不够，运输过程不满足样品所需温度或者路途遥远，送检时间超过６ｈ，都会导致样品失效。样品交接时间过长（在样品送入实验室之后，采样人员要将采样记录移交给业务室，然后由接样员对水样进行编号并将检测任务下发到监测室），导致样品没有及时分析而超过时限。特别是，在执法监测和污染源监督性监测中，需要的采样时间长，有时还需
要 分 时 间 段 监 测，这过程很容易造成样品超时。并且，样品保存时间越长越不能保证样品在合格的冷藏温度下。这几年，经常出现企业和监测机构因该项目实验的特殊性发生纠纷。建议在采集细菌样时，车上安装车载冰箱、冷藏箱或者其他冷藏设备，可以实时监测温度。加入冰块保存时，样品不可以直接接触冰块。不能保证样品在有效期内送达实验室分析时，可以考虑使用刚刚出台的酶底物法（HJ1001-2018）进行现场检验。

3、 实验室分析3.1 试剂质量

3.1.1 无菌水

目前很多实验室采用先配置所需量的稀释水到试管中再统一灭菌。在实验分析时发现由于稀释水在高压灭菌和冰箱存放这一系列过程中挥发，导致稀释水在做样时达不到所需的量。建议先用大容量玻璃瓶统一准备足量的无菌水和100ｍL的量筒，使用时在无菌环境下按所需量进行分装。无菌水的配制尽量在当天或实验前一天配置，ZUI好实验当天进行配制。无菌水需要调pH值、可在常温保存。

3.1.2培养基

培养基的质量是整个实验检测结果的保障，是实验室质量控制的重要环节。分 析人员可能认为只要培养基在保质期内，都是合格的，而忽略了对培养基进行质量控制。

培养基需在湿度低、温度不超过３０ ℃的房间避光保存，避免杂菌侵入。配置前，应该观察培养基颜色和体积，变化明显时废弃不用。配好的培养基需要在２ｈ内进行高压灭菌；对于不能及时灭菌的培养基，可以在冰箱内存放且不超过一天，因为灭菌不及时，就会影响其杀菌效果和营养成份的含量。培养基灭
菌结束后应迅速冷却，避免长时间保存在灭菌锅内，容易造成灭菌过度从而影响培养基的营养成分。配置的培养基不宜存放过久，坚持多配少量的原则，尽 量在一周内用完为好。每批培养基在使用前，都应对培养基进行质量鉴定，只有经过验证合格的培养基，才能投入使用。

3.2 操作方法

3.2.1 稀释倍数  

有时候，企业污水、医疗废水等粪大肠菌群污染严重的水样需要稀释到10-4～10-5ｇ／mL之后接种，但分析人员不能准确判断其大致稀释倍数，容易出现超出或者低于定量范围。现行的环境监测分析方法与有关技术规范中粪大肠菌群检数表里所列的几个不定值（“＜”或“＞”）给监测工作带来一定的困难。能否选择出正确的稀释度是实验成败的关键。

接种的稀释比，为了避免在实 测 数 据 中 出 现 不 定值，实验分析人员应充分了解自己所做区域各种水样的稀释比，根据待检水样的环境因素和水样性质确定合适的稀释比。采样人员尽量将样品性质、受污染程度在采样记录上描述清楚，以供分析人员选择合适的分析方法。对于不确定稀释范围的水样，可以进行多种梯度稀释。

3.2.2 结果判读

在使用多管发酵法测试时，如果在初发酵试验中未发现产气，可以适当地延长培养时间到48ｈ。

在使用酶底物法测试时，在培养24ｈ后结果为可疑阳性或者无颜色反应，可 适 当 延
长 培 养 时 间 到28ｈ进行结果判读，超过28ｈ之后出现的
颜 色 反 应 不 作 为阳性结果。如果样品有背景颜色，需做一个空白试验，与标准盘作比较。如果加入培养基，样品颜色过深，可能是余氯过多或者pH值过低的原因，这种方法就不适用了。

4、质量控制

4.1 质控措施

粪大肠菌群项目的监测起步比较早，但是之前一直作为非标项目，粪大肠菌群的质控标准菌株也是在近两年才兴起。大部分实验室分析人员之前没有接触过
质控，也没有接受过这方面知识的培训，在近两年密码样考核和实验室间比对中，该项目的效果不是很好。

目前国内使用的有证标准菌株几乎都是从国外购买的，价格贵、购买渠道复杂且不易保存。国内实验室很少有达到对每批样品 使 用 有 证 标
准 菌 株 进 行 阳 性、阴性对照试验。微生物的质控、盲样制作难度较大，影响了国内实验室关于微生物方面质量控制的开展。尽管如此，各个实验室也应该尽量做到，定期使用有证标准样品进行质量控制，使用有证标准菌株进行阴阳性对照试验。酶底物法要求，每年至少必须进行６次定量试验、４次定性试验。

4.2 空白和平行性

以前使用的多管发酵法、滤膜法等对空白和平行性没有明确的要求。大部分实 验室也仅限于对每批样进行空白测定。

无论用哪种方法检测，建议每个月要对实验室用水做质量检测，每批样品要用无菌水做全程序空白和实验室空白测定，确保检测结果的准确性和可靠性。使用酶底物法分析时，对20个样品或每批次样品测定一个平行双样。